清洁二氧化碳培养箱是指去除灰尘、污垢和有机污渍。清洁方法包括刷、吸、干擦、洗涤或用浸泡肥皂水或清洁剂的湿布拖擦。粉尘、污物以及有机物是微生物的栖身之所，并可能影响除污染剂(抗菌剂、化学杀菌剂以及消毒剂)的作用。
培养箱必须先经过清洁才能实现消毒和灭菌的目的，许多杀菌剂只对经过清洁过的物品才具有杀菌活性。清洁时必须使用与以后使用的消毒剂或杀菌剂化学性质上相容的试剂进行清洁、消毒。
①清洁箱体表面：先拂去表面的灰尘，再用湿的海绵或软布清洗，再用软布擦干。如果有污物则用低浓度的清洁剂清洗，然后擦干。
②清洗箱体内部：选择合适的消毒剂。所有的物件和表面必须彻底清洗，然后用无菌水冲洗，再擦干或晾干。
③清洗玻璃门：清洗箱内的玻璃门时使用的清洁剂和清洗培养箱内部时使用的相同。然后用蒸馏水漂洗，从而清除残留的清洁剂，最后用软布把门擦干。
二氧化碳培养箱的消毒和灭菌
消毒是指杀死微生物的物理或化学手段，但不一定杀死其孢子。灭菌是指杀死所有微生物，当培养箱内细胞受到污染时则需要采取灭菌措施。一般，在培养箱内细胞没有污染的情况下平均1-3个月彻底消毒一次。的3种消毒灭菌的方式是：液体消毒剂、紫外和加热。
①液体消毒剂：选择对培养箱无腐蚀性的液体消毒剂，并且液体消毒剂的消毒效果好坏和很多因素有关。比如：场所的温度、接触时间、pH、穿透能力、有机物的反应。这些因素中的一些很小的变化可能会造成去污剂的效力上大的不同。因此甚至在很有利的情况下，当最终要求必须无菌时，液体去污剂也不是完全可信赖的去污方法。
②紫外消毒：一般先用蒸馏水清洗干净后，再用培养箱自带的紫外灯照射一天或者用手提式的紫外灯照射。因被遮挡时或距离远时都会削弱紫外灭菌的效果，紫外灭菌方式较为简单。
③加热：湿热和干热被认为是杀菌最有效的方法。在一般环境下，高压灭菌器加热到121℃快速产生蒸汽是的方法，但是二氧化碳培养箱无法进行高温高压灭菌，只能退而求其次进行90℃湿热灭菌，但90℃因为温度过低，起不到100℃以上水蒸汽所带来的渗透性和高压力效果，所以灭菌效果也大打折扣.而干热140℃-180℃，可以起到彻底灭菌的作用。
